三、細胞增殖的染色稀釋實驗

CFSE和Cyto Tell^TM指示劑是流式細胞術用于檢測活細胞增殖的熒光追蹤染料。當細胞分列時，熒光染料在自細胞之間均與分布，導致熒光強度隨每一代的發展而減半。這些增值染料可以長期用于追蹤細胞增殖。

 

應用CFSE進行細胞增殖檢測

CFSE（#22022）和RediUse是細胞滲透型綠色熒光增殖指示劑，當被488nm氬離子激光激發時，在517nm出發出熒光信號。兩種染料被動的擴散并穿過未受損的細胞膜，由此與細胞內脂酶的酶反應從CFSE切割乙酸基以產生與細胞內蛋白質共價結合的胺反應性羧基熒光素SE。雖然CFSE仍然被廣泛用作在498nm激發下的綠色熒光增殖指示劑，但它絕非無條件。CFSE對細胞具有局毒性，容易發生染料泄露，并且會溢出到PE和PE-Texas紅通道中。

 

細胞增殖指標

        Cyto Tell^TM 染料是一系列細胞滲透型熒光示蹤劑，旨在監測活細胞的細胞增殖，而不存在任何缺點的CFSE。細胞膜被動擴散后，CytoTell^TM 染料被細胞內酯酶水解以產生高度熒光的胺反應性或硫醇反應性染料，其不可逆地與細胞內蛋白質上的胺或硫醇基團結合。細胞毒性很小，經過幾代的分裂，染料在細胞內保留得很好。使用 CytoTell^TM UltraGreen (22240)可視化多達9代。CytoTell^TM 染料有7種不同的熒光發射 顏色，在多色分析中提供更大的靈活性。他們可以固定和滲透，以分析細胞內目標使用標準甲醛含固定劑和皂甙為基礎的滲透緩沖液。

圖1.CytoTell^TMGreen和CFSE檢測細胞增殖。在第0天將 Jurkat 細胞(- 2x106個細胞/mL)用 CytoTell^TM Green 或 CFSE 染色。然后在指定的日期以1:1的比例連續傳遞細胞。用 ACEA NovoCyte 3000流式細胞儀測定通過當天 FITC 通道的熒光強度。不同的顏色峰代表連續幾代。

表1.用于流式細胞儀的 CytoTell^TM 和 CFSE 細胞增殖染料

四．細胞增殖分析

       ATP 存在于所有代謝活躍的細胞中，在死細胞中幾乎不存在，是鑒定活細胞的合適的生物標志物。ATP 的定量分析已被用于確定哺乳動物細胞中的細胞增殖和細胞毒性，并用于檢測水、土壤和血液等樣品中的低水平污染。雖然可以使用多種檢測方法，但由于其較高的靈敏度，研究人員通常選擇基于熒光素-熒光素酶生物發光的 ATP 分析來測量細胞增殖。PhosphoWorksTM發光 ATP 測定試劑盒提供了一種簡單和均勻的方法來測量 ATP 使用螢火蟲螢光素酶及其底物螢光素。在 Mg2 + 存在下，螢火蟲螢光素酶催化螢光素、 ATP 和 O2的反應，產生約560nm 的光，可以用光度計檢測到。存在的 ATP 濃度與樣品中活細胞的數量成正比。也可以使用 PhosphoWorksTM 比色 ATP 測定試劑盒(21617)和 PhosphoWorksTM 熒光 ATP 測定試劑盒(21620) ，其可以分別在100μL 反應體積中檢測約3μM 或約0.4 μM 的 ATP。

圖2.使用 NOVOstar 讀板器(BMG Labtech)在96孔板上使用 PhosphoWorks^TM 發光 ATP 測定試劑盒 * DTT-Free * 測量 Jurkat 細胞。這個試劑盒可以檢測到低至100個細胞。積分時間為1秒。

表2.測定細胞增殖的ATP實驗