多細胞生物是由高度組織化的細胞群落組成的，為了這個細胞群落的茁壯成長，重要的是1.通過復雜的細胞過程，如細胞增殖和凋亡，2.建立穩態。這兩個過程中任何一個過程的不適當轉變都會導致病癥。例如，神經元凋亡活性的增加是各種神經退行性病癥如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的根源。相反，凋亡機制的喪失會導致細胞過度生長，這是細胞癌變的潛在機制?？偟膩碚f，細胞凋亡在病癥中的作用是科學研究中的熱門話題。

細胞凋亡

圖1.概述了與細胞凋亡相關的所有參數。必須注意，這些事件不是按順序發生的。它們中的許多將重疊，并且常常同時發生。事件1到4是凋亡的生化特征，不一定以細胞死亡結束。下游凋亡事件5到8是細胞發生凋亡的標志，此后細胞存活的可能性很小。

細胞凋亡是一種復雜的細胞程序性死亡途徑。這種細胞自主活動過程的特點有幾個不同的形態和生化標記，包括細胞和核收縮，染色質凝聚，細胞質膜泡和核DNA斷裂。這些形態學變化都源于兩種凋亡途徑：外源性或內源性途徑。外源性途徑是由細胞外死亡受體配體（如腫瘤壞死因子（TNF）或Fas配體（FasL））激活的受體介導的途徑。內源性途徑是由環境應激引起的線粒體膜通透性和凋亡誘導因子（AIF）和細胞色素c的釋放在細胞內誘導的。這兩種途徑的信號通過caspase級聯傳遞，導致caspase激活的核酸酶對細胞核DNA的下游消化。細胞凋亡的這些特征使得DNA片段分析能夠作為識別細胞凋亡的決定因素。

DNA片段的凋亡檢測

目前有各種各樣的技術可以用來評估和鑒定凋亡DNA片段。很早的檢測方法是凝膠的DNA階梯分析法，使用瓊脂糖凝膠電泳來可視化和分離DNA片段。凋亡的DNA片段是一個獨特的“梯狀”模式的核體片段約180-200堿基對的長度。雖然該技術在生成定性數據方面很有效，但不適應高通量的應用。

另一種檢測方法是用抗DNA和抗組蛋白抗體組成的雙抗體夾心ELSIA法來觀察細胞凋亡過程中DNA的斷裂。盡管這種檢測方法在檢測凋亡DNA片段方面更為敏感，并且易于高通量使用（例如復合篩選），但它需要長時間手動操作，并且抗體的使用比較昂貴。

TUNEL測定

1992年，Gorczyca等人引入了一種新的用于DNA片段凋亡檢測的方法，該方法利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）和切口平移或TUNEL測定法測量凋亡性DNA片段化。TdT催化將熒光團標記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到DNA雙鏈斷裂（DSB）的3'-羥基末端。

自從引入TUNEL檢測法以來，它已成為一種廣泛認可的用于鑒定凋亡細胞死亡的原位技術。與以前的方法相比，TUNEL測定具有更靈敏的能力，可以在幾個數量級上進行廣泛的定量測量。多年來，TUNEL技術已經針對顯色和熒光檢測方法進行了調整和優化。熒光TUNEL檢測利用與生物素偶聯的dUTP和酶標記的抗生蛋白鏈菌素進行高靈敏度染色。熒光檢測方法依賴于熒光染料偶聯的dUTP，可直接檢測DNA片段。

影響TUNEL染色的因素有許多。其中一些變量包括試劑濃度、樣品固定和DNA鏈斷裂后的末端連接等，這些可能因組織或細胞樣品類型而異。

Cell Meter TUNEL細胞凋亡檢測

AAT Bioquest的Cell Meter TUNEL細胞凋亡測定法針對熒光檢測進行了優化，可用于綠色或紅色熒光發射。AAT Bioquest的Cell Meter 檢測包括所有必需成分和實驗方案，可以檢測和定量細胞中凋亡的DNA片段。通過使用TdT將熒光染料修飾的脫氧尿苷5'-三磷酸核苷酸（Tunnelyte Green或Tunnelyte Red）催化并入DNA的3'OH末端，來檢測凋亡的DNA片段。然后可以通過流式細胞儀定量標記的DNA片段，或通過熒光顯微鏡直接觀察。

圖2.用誘導凋亡的化學物質星形孢菌素（SS）處理HeLa細胞中TUNEL反應的熒光圖像。與未處理的對照相比，將HeLa細胞用100 nM或1μMSS處理4小時。將細胞與反應混合物在37oC下孵育1小時。使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡分析綠色熒光信號。熒光標記的DNA鏈斷裂在SS處理的細胞中表現出強烈的熒光。

Tunnelyte?綠色的497 nm峰值吸收非常適合通過配備488 nm氬離子激光線的儀器進行有效激發。對于發射濾波片的選擇，可以分別使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）濾波片讀取Tunnelyte?綠色或Tunnelyte?紅色。由于Tunnelyte?核苷酸已與藍色光譜充分分離，因此DAPI，Hoechst或Nuclear Violet LCS1等染色劑適用于多色熒光應用中的活細胞復染。

圖3.上：Tunnelyte Green的吸收和發射光譜。激發波長為488 nm（藍色激發光線）。帶有發射濾光片FITC的Tunnelyte Green讀數（綠色波段）。下：Tunnelyte Red的吸收和發射光譜。激發波長為561 nm（綠色激發光線）。帶有發射濾光片Cy5的Tunnelyte Red讀數（紅色波段）。

我們的Cell Meter TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒比其他市售TUNEL檢測試劑盒具有明顯的優勢，因為我們的試劑盒在反應緩沖液中不含二甲基胂酸鈉或鉀。不含二甲基胂酸鈉或鉀有兩個好處，首先，它要穩定得多。其次，它提供了更靈敏，準確的凋亡檢測方法。二甲基胂酸鈉是一種致癌的砷衍生物，由于攝入，吸入或皮膚接觸而具有劇毒。由于毒性，它可以誘導細胞凋亡，在測定中測量細胞凋亡時不可避免地會導致細胞信號干擾。

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