Western 免Y印跡(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上,然后利用抗體進行檢測的實驗。在WB 實驗中常會出現各種問題,而拖慢實驗速度,使實驗達不到理想的效果。今天百螢跟各位同學一起分享下 WB 實驗中各種問題及問題建議。
常見問題
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可能原因
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建議
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電泳條帶成笑臉狀
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膠不均勻冷切,中間冷卻不好,電泳系統溫度偏高
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減少電壓減慢電泳速度,在冷室或者冰浴中進行電泳
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電泳條帶成皺眉狀
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可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不完全
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調整裝置
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拖尾
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樣品溶解不好
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樣品充分溶解混勻后上樣
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紋理(縱向條紋)
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樣品中含有不溶性顆粒
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樣品充分攪拌混勻
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條帶偏斜
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電極不平衡或者加樣位置偏斜
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調整電極和加樣
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條帶兩邊擴散
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加樣量過多
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適當減少上樣量
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Marker 變黑色
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抗體和 Marker 蛋白反應
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在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣
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背景高
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膜封閉不夠
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延長封閉時間,選擇適宜的抗體稀釋度
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一抗稀釋度不適宜
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對抗體進行滴度測試,選擇適宜的抗體稀釋度
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一抗孵育的溫度偏高
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建議 4℃ 結合過夜
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二抗濃度度過高
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降低二抗濃度
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二抗的非特異性背景
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增加一個二抗對照,不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗(特異性更強的,只針對重鏈)
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二抗孵育時間過久
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減少二抗孵育時間
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選擇膜的問題
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硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低
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膜在實驗過程中干過
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實驗過程中要注意保持膜的濕潤
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檢測時曝光時間過長
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注意曝光時間的縮短
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洗膜不充分
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增加洗膜的時間和次數
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抗體和封閉蛋白有交叉反應
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檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性,選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應
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雜帶較多
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目的蛋白有多個修飾位點(磷酸化位點,糖基化位點,乙酰化位點等),本身可以呈現多條帶
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查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白試劑大小
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目的蛋白有其他剪切本
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查閱文獻或生物信息學分析可能性
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樣品處理過程中目的蛋白發生降解
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裂解液中加入蛋白酶抑制劑,樣品處理在冰上進行
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上樣量過高,太敏感
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適當減少上樣量
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一抗不純
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純化抗體
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一抗特異性不高
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重新選擇或制備高特異性的抗體
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二抗的非特異性結合
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增加一個二抗對照,不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否是由于二抗所致??蛇x擇其它二抗(特異性更強的,只針對重鏈)
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一抗或二抗濃度偏高
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降低抗體濃度
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細胞傳代較多,導致蛋白變異
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使用原代或傳代少的細胞作對照
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蛋白條帶位置
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二聚體或多聚體存在
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增加蛋白質變性過程及強度
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翻譯后剪切
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比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的,在執行功能時需要進行剪切成活化的形式
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相對電荷
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氨基酸電荷的組成
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蛋白修飾
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比如糖基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加
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膠濃度
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不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差
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無蛋白條帶
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抗體孵育不充分
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增加抗體濃度,延長孵育時間
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酶失活
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直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
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標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
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設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
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試劑之間不匹配
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一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性
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一抗失效
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選擇在有效期內抗體,幷選擇現配現用的工作液
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HRP 抑制劑
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所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉
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抗體不能識別測試種屬的相關蛋白
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購買抗體前應認真閱讀抗體說明書,確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白
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二抗與一抗不匹配
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選擇針對一抗來源種屬的抗體
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蛋白條帶信號弱
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抗體孵育不充分
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增加抗體濃度,延長孵育時間
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酶活性降低
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直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
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洗膜過度
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洗膜時間不宜過長,加入的去垢劑不宜過強或過多,建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20
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標本中靶蛋白含量太低
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增加樣本上樣量
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抗體活性降低
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選擇有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置
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蛋白轉移不充分
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可以用麗春紅染膜幷結合染膠(考馬斯藍)后確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度,適當調整轉膜的時間和電流
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封閉過度
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減少封閉劑的量或縮短時間,換用不同封閉劑類型
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曝光時間過短
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延長曝光時間
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HRP 抑制劑
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所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉
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背景有黑色斑點
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抗體與封閉試劑反應
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使用前過濾封閉試劑
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HRP 偶聯二抗中有聚集體
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過濾二抗試劑,去除聚集體
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暗背景上白色帶
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HRP 含量過高
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降低酶聯二抗的濃度
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背景有不均勻的白色斑點
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轉膜過程中有氣泡存在
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仔細檢測,避免存在氣泡
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抗體分布不均勻
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孵育抗體時使用搖床
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