如何避免鈣離子檢測時遇到的避免高背景？信號強度低？AAT Bioquest 曾推出過一系列產品：Calbryte?，它是用于檢測細胞內鈣離子濃度的，比Fluo-4等傳統熒光探針有更好的實驗效果。
Calbryte?包括三種新的鈣離子指示劑：Calbryte?520，Calbryte?590和Calbryte?630。Calbryte?系列已針對熒光顯微鏡，熒光酶標儀和流式細胞儀進行了優化，它們還可用于高通量篩選應用。 與傳統的Fluo-3、Fluo-4比較，Calbryte?探針具有幾個關鍵優勢 ：Calbryte?探針可產生更明亮的信號，顯著改善的信號與背景比，并大大增強細胞保留。這些特性使Calbryte?系列成為比傳統的鈣指示劑更好的選擇。
圖1 Fluo-4，AM（左）和Calbryte TM 520 AM（右）在CHO-K1細胞中測量ATP響應。將CHO-K1細胞以50,000個細胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入含有丙磺舒或10μg/ ml Fluo-4的AMH緩沖液中的100μL10μg/ ml Calbryte TM 520AM，在含有丙磺舒的HH緩沖液中的AM，并在37℃下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液并用200μLHH緩沖液/孔替換。加入ATP（50μL/孔）以達到10μM的*終指示濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。
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Calbryte?系列探針根據其*大發射波長命名 。例如，Calbryte?520在可見光譜的綠**域發出熒光，而Calbryte?590和Calbryte?630分別在紅色和深紅**域發出熒光。所有三種指標均可以AM酯形式或鹽形式（作為鉀鹽）獲得。AM酯形式是細胞可滲透的形式，其可用于測定活細胞中的鈣。鹽形式主要用于鈣指示劑的校準。當根據熒光信號強度計算細胞內鈣濃度時，通常需要該步驟。Calbryte TM的鹽形式也可用于顯微注射到活細胞和組織中。
Calbryte?染料如何在活細胞中發揮作用？
當測定活細胞中的鈣時，優選的方法是用幾種乙酰氧基甲酯（AM酯）官能團合成Calbryte TM染料。這樣做的原因是：
1.AM酯是親脂性基團，當連接到Calbryte TM核心結構時，產生總體上更疏水的化合物。這種增加的疏水性使Calbryte?AM酯易于滲透完整的脂質膜并滲透到活細胞中。這消除了對電穿孔，顯微注射或其他類似破壞性加載技術的需要。
2. Calbryte TM染料雖然是AM酯形式，但基本上是非熒光的且不可激活的。只有當Calbryte?探針滲透到細胞中時，只有在細胞內酯酶切割AM酯功能基團后，Calbryte?染料才會被激活并對鈣有反應。這種兩步激活過程很重要，因為它極大地減少了非特異性的背景熒光。并且通過擴展，它顯著增強細胞內鈣信號。
一旦Calbryte?探針被激活，它就會通過典型的螯合作用來檢測鈣處理。然而，與其他螯合劑如Fluo-3和Fluo-4不同，Calbryte?染料在與鈣結合時顯示出更大的響應。在實驗中，Calbryte?探針顯示螯合時熒光增加超過300倍。相比之下，Fluo-4僅增加了100倍。熒光響應的這種顯著改善允許對傳統鈣指示劑無法檢測的鈣進行極其穩定的檢測。
使用Calbryte?染料有什么好處？
Calbryte?探針勝過更傳統的鈣質指標。在活細胞實驗中，Calbryte?染料產生的信號與背景比率比其他染料如Fluo-4高出一個數量級。這是實驗研究的一大優勢。正如許多研究人員所證明的那樣，信號與背景比率差是數據分析的頭疼問題。它將結果與噪聲混合在一起，掩蓋了潛在的重要數據，并導致大量的分析 - 分析變異性。出于這個原因，在選擇試劑時，大多數研究人員更喜歡具有良好信噪比的信號。
信號與背景比率差可能是由多種因素引起的，這些因素主要分為兩類。首先，有些因素會導致信號強度不佳。這些可包括：
1. 低消光系數或量子產率
2. 目標結合不佳
3. 遠離激發源的吸光度*大值（λmax）
Calbryte?探針的研發就是為了解決這些問題。例如，Calbryte?520的量子產率是Fluo-3或Fluo-4的三倍。這意味著每吸收光的光子，Calbryte?520從根本上發出比Fluo-3或Fluo-4更多的熒光，從而產生更亮的信號強度。此外，Calbryte?系列中的所有染料都經過精心設計，使其*大吸光度出現在標準激發源附近。例如，Calbryte?520（λmax = 492 nm）被 常見的488 nm氬離子激光線激發。
許多探針表現出差的信號與背景比的**個原因是由于高背景。高背景可能是由于：
1. 細胞不透性
2. 高自發熒光
3. 非特異性激活/結合
4. 細胞保留不佳
這些因素中的許多是相關的，因為它們涉及探針進入細胞并在細胞質中有效定位的能力。觀察許多過去的鈣指標，它們經常遇到兩個問題之一。1）探針可以是相當水溶性的，但是太親水而不能滲透活細胞。2）它們具有足夠的疏水性以滲透活細胞，但是具有如此差的水溶性以至于它們在加載過程中會從溶液中沉淀出來。這兩種情況都不可取。使用Calbryte?系列時，面臨的挑戰是創造一種在水溶性和細胞滲透性之間達到微妙平衡的探針。Calbryte?系列通過操縱水溶性官能團和上述AM酯基解決了這個問題。
鈣指示物在活細胞實驗中表現不佳的另一個原因是細胞保留不佳。這里的問題在于一個叫做p-糖蛋白1的蛋白質家族 （P-gp）的。在許多細胞中（例如研究良好的HeLa細胞系），P-gp充當ATP依賴性外排泵，主動將大范圍的小分子從細胞內移動到細胞外空間。關于鈣指示劑，這引起問題，因為活化的鈣指示劑可以通過這些泵“泄漏”出細胞并進入細胞外基質。這種類型的泄漏導致雙重問題。首先，因為泄漏的鈣探針已被激活（由于通過細胞內酯酶去除AM酯），它們將與細胞外基質中的游離鈣結合并發熒光。然而，該熒光不是感興趣的信號，因此有助于已知的高背景或噪聲。**，探針泄漏到細胞外空間導致細胞內探針的減少。這導致細胞內鈣的檢測減少和信號強度降低，進一步加劇了該問題。
一個已被熟練使用的解決方案是將丙磺舒與鈣指示劑一起使用。Probenecid是一種通道阻滯劑，在減少探針泄漏方面取得了一定的成功。但是，它的使用遠非理想的解決方案。這是因為有許多實驗目標對丙磺舒非常敏感。例如，已顯示感覺神經節的TRPV2受體被丙磺舒激活。另一方面，丙磺舒似乎對TAS2R受體或味覺受體具有抑制作用。對于許多其他血清敏感或**敏感的靶標，丙磺舒的作用可能在很大程度上是未知的。這意味著通過使用丙磺舒，研究有可能將完全未知的因素引入實驗設計中。
Calbryte?注意到現有鈣指示劑存在的這一嚴重問題，專為高性能而設計，無需丙磺舒。Calbryte?染料通過仔細平衡化合物上的離子電荷來實現這一目標。這導致帶負電荷的親水性分子，一旦進入細胞內，就顯示出顯著減少的細胞滲漏。在無丙磺舒條件下，Calbryte?染料在信號背景比方面優于Fluo-4一個數量級。
Calbryte?染料的*后一個優點是它們非常適合高通量篩選（HTS）和**發現應用。由于Calbryte?染料具有如此出色的信號與背景比，因此可以無洗滌形式使用（見Cat#36317）。此外，由于不需要添加丙磺舒，Calbryte?染料可以很容易地用于自動化設置。
用Calbryte TM 520 AM和Fluo-4 AM在CHO-M1細胞中測量卡巴膽堿劑量反應。將CHO-M1細胞以50,000個細胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入在HH緩沖液中的100μL10μg/ ml Calbryte TM 520AM或在HH緩沖液中的10μg/ ml Fluo-4，并在37℃下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液并用200μLHH緩沖液/孔替換。通過FlexStation 3添加卡巴膽堿（50μL/孔）以達到*終指示的濃度。
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