簡介

Calcein AM是一種疏水性化合物，可以很容易地滲透到完整的活細胞中。 它廣泛用于細胞活力測定。 通過細胞內酯酶水解非熒光鈣黃綠素AM產生強熒光的親水鈣黃綠素，其在細胞質中良好保留。 酯酶活性與活細胞數成正比，因此與熒光強度直接相關鈣黃綠素產生自酯酶催化的鈣黃綠素AM水解。 Calcein AM是用于標記和監測活細胞細胞功能的流行的熒光探針之一。 然而，Calcein AM的單色使得在多色應用中不可能使用這種有價值的試劑。 例如，由于鈣黃綠素AM具有與GFP相同的顏色，因此不可能將鈣黃綠素AM與GFP轉染的細胞組合使用。

光譜特性

為了解決上述Calcein AM的顏色限制，我們開發了Calcein Orange?和Calcein Red?。 這兩種新的Calcein AM類似物與Calcein AM結合使用，可以對活細胞進行多色標記和功能分析。 此外，我們還開發了CytoCalcein?Violet 450，CytoCalcein?Violet 500，CytoCalcein?Blue 550和CytoCalcein?Blue 600，用于流式細胞儀應用。 CytoCalcein?染料與Calcein具有相似的生物學特性，它們針對各種流式細胞儀的激發波長進行了優化，為活細胞的流式細胞分析提供了額外的顏色。 CytoCalcein?Violet 450和CytoCalcein?Violet 500被紫激光（405 nm）激發，并分別在450 nm和500 nm發出熒光。 CytoCalcein?Blue 550和CytoCalcein?Blue 550被藍色激光（488 nm）激發，并分別在550 nm和600 nm處發出熒光。

表1.細胞活力檢測試劑的光譜特性

使用細胞活力指標AM酯類

AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應在使用前重新配制上等無水二甲基亞砜（DMSO）。 DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應穩定數月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。 該步驟僅提供指南，應根據您的特定需求進行修改。

a）在高質量無水DMSO中制備2至5mM AM酯的儲備溶液。非離子的洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加AM酯的水溶性。

注意：可將等體積的20％Pluronic®F-127溶液添加到DMSO儲備溶液中細胞活力指示劑在稀釋到上樣緩沖液之前。Pluronic®F-127

濃度約為0.02％。各種Pluronic®F-127解決方案可從AAT獲取

注意：不建議在Pluronic®F-127存在下長期儲存AM酯。

b）在實驗當天，要么在DMSO中溶解細胞活力的固體指標，要么溶解細胞活力將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。準備一個有效的解決方案在您選擇的緩沖液中1至10μM（如Hanks和Hepes緩沖液）。對于大多數細胞建議濃度范圍為4至5μM的細胞活力指標。細胞加載所需指標的確切濃度必須根據經驗確定。

c）如果您的細胞含有有機陰離子轉運蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮可以向細胞培養基中加入（0.1-0.25mM）以減少脫酯化指示劑的泄漏。在室溫或37℃下將細胞與AM酯孵育20分鐘至1小時。

注意：降低加載溫度可能會降低指示器的劃分。

d）在細胞活力指示劑緩沖液（含有陰離子轉運蛋白抑制劑，如果適用）中洗滌細胞以除去過量的探針。

注意：通過流式細胞術立即分析細胞樣品，以確定零時間的每個細胞的平均熒光而不洗滌。

e）在所需的Ex / Em波長下進行實驗（見表1）。

儲存條件：

儲存于-20°C，避光。 到期日為自收到之日起6個月。

參考文獻

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