基本信息
貨號：15276（assays）
儲存條件：保存在冰箱并避光
適用儀器：酶標儀
簡介
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH的短紫外波長
分析使傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite?比色總NADP / NADPH檢測試劑盒為檢測總NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NADP / NADPH。無需從樣品混合物中純化NADP / NADPH。酶循環反應顯著提高了檢測靈敏度。 NADPH探針是一種生色傳感器，在NADP減少時具有460nm的吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite?比色總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測低至0.03μM的總NADP / NADPH。與套件＃15260相比，該套件具有更高的靈敏度。
試劑盒組成
96孔板測定方案
簡要總結
準備NADP / NADPH反應混合物（50μL）®
添加NADPH標準品或測試樣品（50μL）®
在室溫下孵育15分鐘至2小時®®
監測460 nm處的吸光度
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個
步驟
1.準備NADPH原液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol /μL）NADPH儲備溶液。
注意：未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 oC。
2.制備NADP / NADPH反應混合物：
2.1將8 mL NADPH探針緩沖液（組分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
2.2將2 mL NADPH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來自步驟2.1）并充分混合。
注意：這種NADP / NADPH反應混合物足以進行200次分析。 未使用的NADP / NADPH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。
3.準備NADPH標準品的連續稀釋液（0至2μM）：
3.1將2μL的1mM NADPH儲備液（來自步驟1）加入998μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，得到2μM（2 pmols / L）NADPH標準溶液。
注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩定，應在4小時內使用。
3.2取200μL的2μMNADPH標準溶液（來自步驟3.1）進行1：2連續稀釋，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0mM系列稀釋的NADPH標準品。
3.3如表1和2中所述，將NADPH標準品和含有NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養板中。
注意：根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細胞。 （詳見附錄）。
表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局
注意：NS = NADPH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品。
表2：每個孔的試劑組成
*注意：將連續稀釋的NADPH標準品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>30μM，濃度）將導致飽和信號并使校準曲線非線性。
4.在上清液反應中運行NADPH測定：
4.1將50μL的NADP / NADPH反應混合物（來自步驟2.2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADP / NADPH測定體積為100μL/孔
注1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNAP/ NADPH反應混合物。
注2：根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細胞。 （詳見附錄）。
4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。
4.3使用吸光度讀板儀在460 nm處監測吸光度的增加。
數據分析
空白孔中的吸光度（僅用PBS緩沖液）用作對照，并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。 NADPH標準曲線如圖1所示。
圖1。 使用SpectraMax酶標儀（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite TM比色總NADP和NADPH測定試劑盒*增強靈敏度*測量NADPH劑量反應。 孵育1小時（n = 3）可以檢測到低至0.03μM的NADPH，在460nm處測量吸光度。
附錄：使用組分D（裂解緩沖液）的測試樣品制劑
1.植物細胞樣品：用200mg / mL的裂解緩沖液均質化，并以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進行測試。
2.**細胞樣品：離心收集**細胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液，將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉速5分鐘，用上清液進行試驗。
3.哺乳動物細胞樣品：從平板孔中取出培養基，每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液（或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔），并將處理過的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，使用上清液進行測試。
4.組織樣品：稱取約20mg組織，用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進行測定。
參考文獻
1. Eugenia Villa-Cuesta, Marissa A. Holmbeckand David M. Rand. Journal of Cell Science (2014) 127, 2282–2290 doi:10.1242/jcs.142026.
2. Chao Tong, Alex Morrison, Samantha Mattison, Su Qian, Mark Bryniarski, Bethany Rankin, Jun Wang, D. Paul Thomas, and Ji Li. FASEB J, Nov 2013; 27: 4332 - 4342.
3. Rubin Tan, Jiansha Li, Xiaochun Peng, Liping Zhu, Lei Cai, Tao Wang, Yuan Su, Kaikobad Irani, and Qinghua Hu. Cardiovasc Res, Oct 2013; 100: 19 - 27.
4. Stephen Y. Xue, Valeria Y. Hebert, Danicia M. Hayes, Corie N. Robinson, Mitzi Glover, and Tammy R. Dugas. Toxicol. Sci., Aug 2013; 134: 323 - 334. 5. Kate J. Roberts, Andrew Cross, Olga Vasieva, Robert J. Moots, and Steven W. Edwards. J. Leukoc. Biol., Sep 2013; 94: 481 - 492.
5. Weijing Cai, Maya Ramdas, Li Zhu, Xue Chen, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. PNAS, Sep 2012; 109: 15888 - 15893.
6. Yue Qiu, Claus Tittiger, Claude Wicker-Thomas, Ga?lle Le Goff, Sharon Young, Eric Wajnberg, Thierry Fricaux, Nathalie Taquet, Gary J. Blomquist, and René Feyereisen. PNAS, Sep 2012; 109: 14858 - 14863.
8. Jaime Uribarri, Weijing Cai, Maya Ramdas, Susan Goodman, Renata Pyzik, Xue Chen, Li Zhu, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Potential role of AGER1 and SIRT1. Diabetes Care 2011; 34: 1610 - 1616.