超實用的幾種細胞膜熒光探針的染色細節解析：

    DiA，DiI，DiO，DiD 和DiR 染料是用于標記細胞膜和其他疏水結構的親脂熒光染料家族。當摻入膜中或與親脂性生物分子如蛋白質結合時，這些對環境敏感的染料的熒光大大增強，盡管它們在水中是弱熒光的。它們具有高消光系數，極性依賴性熒光和短激發態壽命。一旦應用于細胞，這些染料在細胞質膜內橫向擴散，導致整個細胞在其*佳濃度下均勻染色。 DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR（深紅色熒光）的獨特熒光顏色為活細胞的多色成像和流式細胞分析提供了便利的工具。 DiO 和 DiI 可分別與標準 FITC 和 TRITC 過濾器一起使用。其中 DiD 被 633 nm He-Ne 激光器激發，細胞膜熒光探針具有比 DiI 更長的激發和發射波長，為標記具有顯著內在熒光的細胞和組織提供了有價值的替代方案。由于紅外光通過細胞和組織的有效傳輸以及紅外范圍內的低水平自發熒光，DiR 可用于體內成像或示蹤。

樣品方案分析

  1.制備DiO，DiI DiD，DiS或DiR膜染色溶液：

  1.1制備DMSO或EtOH儲備溶液：儲備溶液應在DMSO或EtOH中以1-5mM制備。

  注意：原液的未使用部分應儲存在-20℃。 避免反復凍/融循環。

  1.2準備工作溶液：將原液（步驟1.1）稀釋到合適的緩沖液中，如無血清培養基，HBSS或PBS，制成1至5 M工作溶液。

  注意：對于不同的細胞類型和/或實驗條件，應根據經驗確定工作溶液的*終濃度。 建議在至少超過十倍范圍的濃度下進行測試。

  2.將細胞染成懸浮液：

  2.1在染料加工溶液中懸浮細胞密度為1×106 / mL（來自步驟1.2）。 2.2在37°C溫育2-20分鐘。 *佳培養時間取決于細胞類型。 首先孵育20分鐘，然后根據需要進行優化以獲得均勻的標記。

  2.3將標記的懸浮管以1000至1500rpm離心5分鐘。

  2.4取出上清液，輕輕地將細胞重新懸浮在預熱（37°C）的生長培養基中。

  2.5按步驟2.3和2.4再洗兩次。

  3.染色貼壁細胞：

  3.1在無菌玻璃蓋玻片上生長貼壁細胞。

  3.2從生長培養基中取出蓋玻片，輕輕地排出多余的培養基。 將蓋玻片放在濕度箱中。

  3.3將100μL染料工作溶液（來自步驟1.2）移至蓋玻片的角上，輕輕攪拌直至所有細胞都被覆蓋。

  3.4將蓋玻片在37°C孵育2-20分鐘。 *佳培養時間取決于細胞類型。首先孵育20分鐘，然后根據需要進行優化以獲得均勻的標記。