定量分析晚期細胞凋亡中DNA片段的直接方法
多細胞生物是由高度組織化的細胞群落組成的，為了這個細胞群落的茁壯成長，重要的是1.通過復雜的細胞過程，如細胞增殖和凋亡，2.建立穩態。這兩個過程中任何一個過程的不適當轉變都會導致**。例如，神經元凋亡活性的增加是各種神經退行性**如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的根源。相反，凋亡機制的喪失會導致細胞過度生長，這是細胞癌變的潛在機制?？偟膩碚f，細胞凋亡在**中的作用是科學研究中的熱門話題。
細胞凋亡
圖1.概述了與細胞凋亡相關的所有參數。必須注意，這些事件不是按順序發生的。它們中的許多將重疊，并且常常同時發生。事件1到4是凋亡的生化特征，不一定以細胞死亡結束。下游凋亡事件5到8是細胞發生凋亡的有力標志，此后細胞存活的可能性很小。
細胞凋亡是一種復雜的細胞程序性死亡途徑。這種細胞自主活動過程的特點有幾個不同的形態和生化標記，包括細胞和核收縮，染色質凝聚，細胞質膜泡和核DNA斷裂。這些形態學變化都源于兩種凋亡途徑：外源性或內源性途徑。外源性途徑是由細胞外死亡受體配體（如腫瘤壞死因子（TNF）或Fas配體（FasL））激活的受體介導的途徑。內源性途徑是由環境應激引起的線粒體膜通透性和凋亡誘導因子（AIF）和細胞色素c的釋放在細胞內誘導的。這兩種途徑的信號通過caspase級聯傳遞，*終導致caspase激活的核酸酶對細胞核DNA的下游消化。細胞凋亡的這些特征使得DNA片段分析能夠作為識別細胞凋亡的*終決定因素。
DNA片段的凋亡檢測
目前有各種各樣的技術可以用來來評估和鑒定凋亡DNA片段。*早的檢測方法是凝膠的DNA階梯分析法，使用瓊脂糖凝膠電泳來可視化和分離DNA片段。凋亡的DNA片段是一個獨特的“梯狀”模式的核體片段約180-200堿基對的長度。雖然該技術在生成定性數據方面很有效，但不適應高通量的應用。
另一種檢測方法是用抗DNA和抗組蛋白抗體組成的雙抗體夾心ELSIA法來觀察細胞凋亡過程中DNA的斷裂。盡管這種檢測方法在檢測凋亡DNA片段方面更為敏感，并且易于高通量使用（例如復合篩選），但它需要長時間手動操作，并且抗體的使用比較昂貴。
TUNEL測定
1992年，Gorczyca等人引入了一種新的用于DNA片段凋亡檢測的方法，該方法利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）和切口平移或TUNEL測定法測量凋亡性DNA片段化。TdT催化將熒光團標記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到DNA雙鏈斷裂（DSB）的3'-羥基末端。
自從引入TUNEL檢測法以來，它已成為一種廣泛認可的用于鑒定凋亡細胞死亡的原位技術。 與以前的方法相比，TUNEL測定具有更靈敏的能力，可以在幾個數量級上進行廣泛的定量測量。 多年來，TUNEL技術已經針對顯色和熒光檢測方法進行了調整和優化。 熒光TUNEL檢測利用與生物素偶聯的dUTP和酶標記的抗生蛋白鏈菌素進行高靈敏度染色。 熒光檢測方法依賴于熒光染料偶聯的dUTP，可直接檢測DNA片段。
影響TUNEL染色的因素有許多。其中一些變量包括試劑濃度、樣品固定和DNA鏈斷裂后的末端連接等，這些可能因組織或細胞樣品類型而異。
Cell Meter TUNEL細胞凋亡檢測
AAT Bioquest的Cell Meter TUNEL細胞凋亡測定法針對熒光檢測進行了優化，可用于綠色或紅色熒光發射。 AAT Bioquest的Cell Meter 檢測包括所有必需成分和實驗方案，可以檢測和定量細胞中凋亡的DNA片段。 通過使用TdT將熒光染料修飾的脫氧尿苷5'-三磷酸核苷酸（Tunnelyte Green或Tunnelyte Red）催化并入DNA的3'OH末端，來檢測凋亡的DNA片段。 然后可以通過流式細胞儀定量標記的DNA片段，或通過熒光顯微鏡直接觀察。
圖2.用誘導凋亡的化學物質星形孢菌素（SS）處理HeLa細胞中TUNEL反應的熒光圖像。 與未處理的對照相比，將HeLa細胞用100 nM或1μMSS處理4小時。 將細胞與反應混合物在37oC下孵育1小時。 使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡分析綠色熒光信號。 熒光標記的DNA鏈斷裂在SS處理的細胞中表現出強烈的熒光。
Tunnelyte?綠色的497 nm峰值吸收非常適合通過配備488 nm氬離子激光線的儀器進行有效激發。對于發射濾波片的選擇，可以分別使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）濾波片讀取Tunnelyte?綠色或Tunnelyte?紅色。 由于Tunnelyte?核苷酸已與藍色光譜充分分離，因此DAPI，Hoechst或Nuclear Violet LCS1等染色劑適用于多色熒光應用中的活細胞復染。
圖3.左：Tunnelyte Green的吸收和發射光譜。 激發波長為488 nm（藍色激發光線）。 帶有發射濾光片FITC的Tunnelyte Green讀數（綠色波段）。右：Tunnelyte Red的吸收和發射光譜。 激發波長為561 nm（綠色激發光線）。 帶有發射濾光片Cy5的Tunnelyte Red讀數（紅色波段）。
我們的Cell Meter TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒比其他市售TUNEL檢測試劑盒具有明顯的優勢，因為我們的試劑盒在反應緩沖液中不含二甲基胂酸鈉或鉀。 不含二甲基胂酸鈉或鉀有兩個好處，首先，它要**得多。其次，它提供了更靈敏，準確的凋亡檢測方法。二甲基胂酸鈉是一種致癌的砷衍生物，由于攝入，吸入或皮膚接觸而具有劇毒。由于毒性，它可以誘導細胞凋亡，在測定中測量細胞凋亡時不可避免地會導致細胞信號干擾。
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