檢測細胞內鈣動員的幾種紅色熒光鈣離子指示劑的比較
今天，我們比較了使用四種紅色熒光鈣指示劑Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM在細胞內的鈣相應檢測結果。 我們使用FlexStation3多模式酶標儀在染料染色的細胞上使用不同劑量的ATP測量動力學響應。與Rhod-3不同，Calbryte 590 AM所需的清洗次數更少，并且可以在不用丙磺舒作為有機陰離子轉運蛋白抑制劑的情況下使用。更長的保留時間和*小的滲漏屬性，使Calbryte 590可用于活細胞中細胞內Ca2+水平的中/高通量分析。
材料和方法
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96孔板（黑色透明底，Greiner Bio-one）
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FlexStation3（分子設備）
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Calbryte 590 AM（AAT Bioquest，#20702）
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Rhod-4 AM（AAT Bioquest，#21120）
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Rhod-3 AM（ThermoFisher，#R10145）
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Rhod-2 AM（AAT Bioquest，#21060）
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PLURONIC ® F-127（AAT Bioquest，#20053）
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丙磺舒（#20061）
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熒光顯微鏡（Keyence）
細胞培養
將倉鼠卵巢-CHO-K1細胞在黑色96孔板中于含10％FBS和青霉素-鏈霉素混合物的Ham's F-12培養基中培養過夜。
鈣染料負載和細胞刺激
細胞加載用5μM鈣染料（Calbryte-590 AM，RHOD-2 AM，RHOD-3 AM或RHOD-4 AM）在培養基中的Pluronic ® F-127（PF-127）和丙磺舒（PBC）在37°C的恒溫箱中培養60分鐘。洗去染料加載溶液，并將200 μLHanks和20 mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）PBC加入板中，并在室溫下孵育30分鐘。將各種劑量的ATP溶液（5X工作溶液）添加到FlexStation3加載室中，并以50 μL的濃度添加到所需的孔中，以達到指示的*終濃度（0-10 μM，3X系列稀釋液）。在裝有PBC的HH緩沖液中的未加載細胞的孔中獲得背景熒光。
儀器設定
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熒光強度，Flex模式
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儀器
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FlexStation 3（分子設備）
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光學設置
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Ex / Em = 540/590 nm截止= 570 nm
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PMT靈敏度
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介質
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讀取模式
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底讀模式
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運行
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200秒
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間隔
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10秒
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讀取次數
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21讀
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添加率
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4 μL /秒
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時間點
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16秒
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結果與討論
為了研究哪種紅色Ca2+染料在96孔板測定中表現*佳，將CHO-K1細胞加載了Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM并用ATP處理刺激P2Y信號，并監測Ca2+水平的細胞內變化。如圖1A所示，Calbryte 590在ATP刺激下表現出*高的信號/背景比，其次是Rhod-4 ，Rhod-3和Rhod-2。
向該測定中添加丙磺舒的目的是通過抑制有機陰離子轉運蛋白來使染料泄漏*小化。我們在沒有丙磺舒的情況下進行了整個測定，并觀察到Calbryte 590在不犧牲信號/背景比的情況下表現*佳。（圖1和圖2）。
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圖1.在存在丙磺舒（左）和不存在丙磺舒（右）的情況下進行Ca2+檢測測定，并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3測量了570 nm的截止波長。
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圖2.熒光成像：在沒有丙磺舒的情況下進行Ca2+檢測測定，并使用TRITC濾光片組使用熒光顯微鏡測量響應。
總結
在96孔板中研究CHO-K1細胞中P2Y1介導的Ca2+信號傳導方面，Carbyte 590和Rhod-4 AM比Rhod-3 AM更好。高性能可用于高通量分析活細胞中細胞內Ca2+的水平測定。
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