今天，百螢為大家介紹使用PCR來對病毒DNA/RNA進行標記、定量、檢測的熒光探針。在臨床分子診斷中，核酸擴增檢測法，例如“逆轉錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）”可以用來早期檢測和鑒定由逆轉錄病毒引起的傳染病。RT-PCR以mRNA為起始模板，可在體外快速轉錄、擴增和檢測逆轉錄病毒的遺傳物質。核酸檢測已成功用于檢測大多數逆轉錄病毒，包括流感病毒，腸病毒，冠狀病毒，埃博拉病毒和HIV。
逆轉錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）
逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）是檢測和定量mRNA表達水平的高度靈敏技術。在RT-PCR中，使用逆轉錄酶將RNA模板逆轉錄為互補DNA（cDNA）。然后使用標準PCR程序（變性，退火和延伸）將cDNA用作擴增模板。RT-PCR可用于多種應用，包括基因表達分析，微陣列，病原體檢測和**研究。
表1.RNA定量試劑/試劑盒
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產品名稱
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Ex（nm）
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Em（nm）
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規格
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貨號
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StrandBrite 綠色熒光RNA定量試劑盒*高選擇性*
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490nm
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540nm
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100 Tests
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17657
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StrandBrite 綠色RNA定量試劑
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490nm
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525nm
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1ml
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17610
|
|
10ml
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17611
|
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Portelite 熒光RNA定量試劑盒
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490nm
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525nm
|
100 Tests
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17658
|
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500 Tests
|
17659
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RT-PCR定量方法及產品
RT-PCR產物的定量方法通?？煞譃閮深悾航K點RT-PCR和實時PCR。終點RT-PCR常用來測量少量樣品中的基因表達變化，而實時RT-PCR已成為在全球范圍內驗證基因表達變化的標準方法。
1.終點RT-PCR
終點RT-PCR是在完成*后一個PCR循環后對PCR產物進行的分析。 用于定量終點RT-PCR的通用測量方法要求通過使用熒光染料（例如溴化乙錠EB）或P32標記的PCR產物的定量來檢測基因表達水平。 終點RT-PCR可用于通過三種不同方法測量表達水平的變化：相對，競爭和比較。
表2.終點RT-PCR檢測方法
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終點RT-PCR
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特點
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相對RT-PCR
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-
利用引物進行內部對照，并與基因特異性引物多路復用
-
需要兼容的內部對照和基因特異性引物
-
可以比較多個樣本之間的相對轉錄本豐度
-
結果用基因信號與內控信號的比值表示，可用于樣本間比較，以估計相對靶RNA的表達
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競爭性RT-PCR
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-
用于**定量樣品中特定mRNA的技術。
-
將合成RNA和競爭RNA添加到樣品RNA復制物中，并與內源性靶標共同擴增
-
產生競爭RNA的濃度曲線，并將其用于比較內源轉錄本產生的RT-PCR信號，以確定樣品中存在的靶標量
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比較RT-PCR
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-
類似于競爭性RT-PCR，在一個單一反應中，靶RNA與一個不相關序列的內標競爭擴增試劑
-
將結果與外標曲線比較，以確定目標RNA濃度
-
這三種方法更方便，因為它不需要預先確定mRNA（相對RT-PCR）或合成競爭性RNA（競爭性RT-PCR）
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2.實時RT-PCR
實時PCR（RT-PCR）使用熒光報告分子來可靠地檢測在PCR過程的每個循環中生成的產物。（隨著反應的進行，由于每個擴增循環中PCR產物的積累，熒光增加。）。這些熒光報告分子包括結合到雙鏈DNA的染料（例如Cyber Green ）或序列特異性探針（例如Molecular Beacons）。
2.1使用DNA結合染料的非特異性檢測
在實時PCR中，DNA結合染料被用作熒光報告基因，以實時檢測PCR反應。隨著產物在每個連續的擴增循環中的積累，報告染料的熒光增強。記錄每個循環的熒光發射量，可以檢測指數期的PCR反應。 Cyber Green 是一種敏感的雙鏈DNA特異性染料，針對實時RT-PCR進行了優化。在溶液中，未與DNA結合的染料幾乎沒有熒光。當染料與雙鏈DNA結合時，熒光會大大增強。與市面常見的SYBR Green相比，Cyber Green一般較少抑制RT-PCR也不太可能導致非特異性擴增。Cyber Green可以在更高的染料濃度高中，產生更強的PCR信號。較高的Cyber Green濃度允許用于qPCR消除“染料再分配”的問題。盡管雙鏈DNA結合染料為實時PCR提供了*方便，*便宜的選擇，但它有一個很明顯的缺點是特異性和非特異性產物均會產生信號。
表3.DNA結合染料
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產品名稱
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Ex（nm）
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Em（nm）
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規格
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貨號
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Cyber Green 核酸凝膠染料 [相當于SYBR®Green] * 20X水性PCR溶液*
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498nm
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522nm
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5 x 1 mL Tests
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17591
|
|
1ml
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17592
|
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Cyber Green 核酸凝膠染料[相當于SYBR®Green]
|
498nm
|
522nm
|
100ul
|
17604
|
|
1ml
|
17590
|
|
Cyber Green 核酸凝膠染料
|
498nm
|
522nm
|
1ml
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TJ1700
|
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Peko Green雙鏈核酸凝膠染料
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502nm
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523nm
|
1ml
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TJ1701
|
|
Cyber Gold核酸凝膠染料
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300nm
|
539nm
|
500ul
|
TJ1702
|
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Cyber Safe DNA 凝膠電泳染料
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280nm
|
530nm
|
500ul
|
TJ1703
|
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JJ Green 核酸凝膠染料
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497nm
|
520nm
|
500ul
|
TJ1704
|
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Ru Red 核酸凝膠染料
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300nm
|
605nm
|
500ul
|
TJ1710
|
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JJ Red 核酸凝膠染料
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518nm
|
605nm
|
500ul
|
TJ1705
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2.2使用目標特異性FRET探針進行特異性檢測
分子信標是一個單鏈寡核苷酸序列，用兩個熒光團標記，并保持“發夾”狀結構。在目標序列的存在下，它們會展開、結合并發出熒光。分子信標由四部分組成：
-
Loop：由與靶序列互補的分子信標的18-30個堿基對區域組成。
-
Stem：在環的兩個末端連接的是兩個相互互補的（5至7個核苷酸殘基）短寡核苷酸。
-
5'末端熒光團：在分子信標的5'末端共價連接有熒光染料。
-
3'末端淬滅劑：在分子信標的3'末端共價連接了一個非熒光猝滅劑。
2.2.1 Tide Fluor 寡核苷酸標記系列產品
Tide Fluor 染料經過優化，可用于FRET寡核苷酸和肽標記。我們的Tide Fluor 染料比香豆素，熒光素，羅丹明和花青等經典標記染料具有更強的熒光性和更高的光穩定性。它們是在不降低性能的情況下標記肽和寡核苷酸的*佳熒光染料。
表4.經典熒光標記染料
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香豆素及其衍生物
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熒光素染料及其衍生物
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羅丹明染料及其衍生物
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花青染料及其衍生物
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吲哚菁綠（ICG）及其衍生物
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表5.Tide Fluor 染料和光譜性質
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Tide Fluor染料
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Abs（nm）
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Em（nm）
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ε 1
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Φ 2
|
260 nm處CF3
|
280 nm處的CF 4
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Tide Fluor 1
|
345
|
442
|
20000
|
0.95
|
0.246
|
0.187
|
|
Tide Fluor 2WS
|
502
|
525
|
75000
|
0.9
|
0.211
|
0.091
|
|
Tide Fluor 2
|
500
|
527
|
75000
|
0.9
|
0.288
|
0.201
|
|
Tide Fluor 3WS
|
555
|
565
|
150000
|
0.105
|
0.079
|
0.079
|
|
Tide Fluor 3
|
555
|
584
|
85000
|
0.85
|
0.331
|
0.201
|
|
Tide Fluor 4
|
590
|
618
|
90000
|
0.91
|
0.489
|
0.436
|
|
Tide Fluor 5WS
|
649
|
664
|
250000
|
0.25
|
0.023
|
0.027
|
|
Tide Fluor 6WS
|
676
|
695
|
220000
|
0.18
|
0.111
|
0.009
|
|
Tide Fluor 7WS
|
749
|
775
|
275000
|
0.12
|
0.009
|
0.049
|
|
Tide Fluor 8WS
|
775
|
807
|
250000
|
0.08
|
0.103
|
0.109
|
-
ε= *大吸收波長處的消光系數（cm -1 M -1）
-
Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產率
-
260 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標記）
-
280 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質標記）
2.2.2 Tide Quencher 淬滅劑系列產品
DABCYL是用于開發各種FRET應用的染料，但對于較長波長的染料（例如熒光素，羅丹明和花青）的低淬滅效率限制了其在敏感的熒光FRET探針開發中的應用，另外，DABCYL的吸收光譜對環境比較敏感。AAT Bioquest已開發出耐用的Tide Quencher 系列產品，用于開發更長波長的FRET探針。Tide Quencher 染料是消除經典淬滅劑限制的**選擇。
Tide Quencher 染料的主要優點：
-
探索其他淬滅劑無法實現的FRET應用。
-
多種反應形式便于自我構建所需的FRET生物分子。
-
與所需的熒光供體完全匹配。
-
更低的價格和更好的性能。
表6.Tide Quencher 染料和光譜性質
|
Tide Quencher 系列染料
|
Abs（nm）
|
ε
|
260 nm時的CF
|
280 nm時的CF
|
|
Tide Quencher 1
|
488
|
20,000
|
0.147
|
0.194
|
|
Tide Quencher 2
|
512
|
21,000
|
0.100
|
0.120
|
|
Tide Quencher 2WS
|
515
|
21,000
|
0.100
|
0.120
|
|
Tide Quencher 3
|
576
|
22,000
|
0.085
|
0.091
|
|
Tide Quencher 3WS
|
576
|
90,000
|
0.186
|
0.205
|
|
Tide Quencher 4
|
604
|
23,000
|
0.146
|
0.183
|
|
Tide Quencher 4WS
|
604
|
90,000
|
0.149
|
0.136
|
|
Tide Quencher 5
|
661
|
24,000
|
0.170
|
0.082
|
|
Tide Quencher 5WS
|
661
|
130,000
|
0.072
|
0.082
|
|
Tide Quencher 6WS
|
691
|
130,000
|
0.120
|
0.102
|
|
Tide Quencher 7WS
|
759
|
140,000
|
0.072
|
0.091
|
2.2.3 Covidyte 肽底物系列產品
Covidyte系列產品是AAT Bioquest針對COVID-19*新研發的肽底物，用于通過FRET檢測冠狀病毒蛋白酶的強度。該系列產品為尋找冠狀病毒蛋白酶抑制劑提供了高靈敏的熒光信號強度。
表7.Covidyte 肽底物
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產品名稱
|
貨號
|
規格
|
Ex(nm)
|
Em(nm)
|
|
Covidyte ED450
|
13537
|
100 Tests
|
334
|
453
|
|
Covidyte EN450
|
13535
|
100 Tests
|
334
|
453
|
|
Covidyte TF670
|
13541
|
100 Tests
|
648
|
663
|
|
Covidyte IF670
|
13542
|
100 Tests
|
654
|
669
|
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