注： PE 和 APC 的完整操作步驟及標記方案在后兩頁，如果不需要看介紹，可直接跳過
藻 紅 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)
特 點 ：
1.從紅藻中純化
2.具有極高的發射量子產率
3.熒光團與蛋白質主鏈共價結合，不被淬滅
4.高水溶性
R-PE 與 B-PE 的 區 別 ：
Wavelength (nm)
Wavelerngn (mm)
R-PE 與 B-PE 的 對 比 ：
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R-PE
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B-PE
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分子量
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240,000
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240,000
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*大吸收
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565 nm
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545 nm
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額外的吸收峰
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498 nm
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564nm
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*大發射
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573 nm
|
573 nm
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消光系數(ε)
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1.96x106 M-1cm-1
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2.41x106 M-1cm-1
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熒光量子產率(QY)
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0.84
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0.98
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吸收比
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A566/A280≥5.0
A566/A498<1.5
A620/A566<0.01
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A545/A280≥5.5
A565/A496<2.7
A620/A545<0.01
|
特 點 ：
1.從藍藻中純化
2.具有極高的發射量子產率
3.熒光團與蛋白質主鏈共價結合，不被淬滅
4.高水溶性
APC 和 C-PC 的區別：
APC 和 C-PC 的對比：
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APC
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C-PC
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分子量
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104,000
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264,000
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*大吸收
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651nm
|
651nm
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*大發射
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662nm
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647 nm
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消光系數(?)
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7.3x105 M-1cm-1
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1.53x106cm-1M-1
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熒光量子產率(QY)
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0.68
|
0.81
|
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吸收比
|
A650/A620≥1.25
A650/A280≥4.5
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A652/A620<0.3
A620/A280>4
|
交 聯 APC 和 APC 的 對 比 ：
1.APC 結構： 它具有α和β亞基，具有明顯的(αβ)3 四級結構。
2.為什么要將APC 進 行 交 聯 ?
答 ：交聯是為了防止APC 在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍) 時
發生可逆解離，從而保持其結構和功能穩定。
3. 如何進行 APC 交聯?
答：通過α和β亞基間的特異性 j聯可以阻止APC 的分解。
交聯比：>1.0
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NaClO4
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A650:A620
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CL-APC
|
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1.465849387
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CL-APC+NaClO4
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+
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1.386850153/
|
|
|
NaClO4
|
A650:A620
|
|
APC
|
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1.587272727
|
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APC+NaClO4
|
+
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0.317901235
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注：圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4, 藍色線條為添加了NaClO4。
如圖及表中信息所示， CL-APC 圖中添加NaClO4 及沒添加NaClO4, 吸收比沒有明顯變化。而在未交聯的APC
中， 添加NaClO4, 得到的吸收比有非常大的變化， 因為APC中加入了NaClO4 導致了它出現了解離。
特 點 ：
1.存在于大多數光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光 譜 特 性 ：
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PerCP
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分子量
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35,000
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*大吸收
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483nm
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*大發射
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676nm
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消光系數(ε)
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4.0x105 M-1cm-1
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熒光量子產率(QY)
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1.0
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亮度(exQY)
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4.9x105M-1cm-1
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吸收比
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A482/A280>4.0
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一 .P E 的 制 備
1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意： PE 在綴合前作為 SAS ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉
淀物*穩定。如果將 PE 以 SAS 沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。
2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3. 檢查 PE 的純度和濃度，請測量280、565 和 6 2 0 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 PE 在 565nm 處的 OD 為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質。
二 .P E 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲備溶液。
2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60 分鐘。
3.將純化的 PE 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少 SMCC 相對于 PE 的量，可能會有所好轉。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含
有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進行綴合。
注意：對于結合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會有所幫助。
四 .進 行 綴 合
1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。 用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60 分鐘。注意：這些
摩 爾 比 ( 每 IgG 約 2 個 PE) 效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所幫 助。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。
注1:整個綴合過程可以在 **內完成。但是，綴合前對APC 的純化可能需要24-48小時。除了下面
列出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml 的抗體溶液。請您在進行APC 抗體綴合實驗之前熟悉
如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注 2 : SMCC-APC 綴合物非常穩定(在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩定幾個月)。因此， 如果您需要節省一部分時間，可以選擇同時綴合10 毫克或更多的 APC, 并將其用于幾次抗體實驗(
在幾周內)。 SMCC-APC 的長期儲存*好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一 .A PC 的 制 備
1.將 APC 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意： APC 在綴合前作為 SAS (硫酸銨鈉)
沉淀物*穩定。如果將 APC 以 SAS 沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。在用每毫 升 1 升的“透析緩沖液”透析之前，用每毫升1 升 APC 的 PBS 進行透析2 次。
2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查 APC 的純度和濃度，請測量280、620和655 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 APC 在 655nm 處的 OD 為 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4 表明雜質被充分去除； 655/280 比 率 > 4 表 明所有其他蛋白質均已充分去除
二 .A PC 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲備溶液。
2.每毫克 APC 加 入 6 μlSMCC, 并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60 分鐘。
3.將純化的 APC 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少 SMCC 相對于 APC 的量，可能會有所好轉。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含
有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進行綴合。
注意：對于結合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會有所幫助。
四 .進 行 綴 合
1.每毫克IgG 添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60 分鐘。注意：這 些 摩 爾 比 ( 每 1gG 約 2 個 APC) 效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所 幫助。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。
1.
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。