一.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺工作原理

 

基于羅丹明的 ATTO 647N 是一種紅色熒光標記，具有與 Cy5 相似的光譜特性。它具有強吸收、高熒光量子產率以及出色的熱穩定性和光穩定性。值得注意的是，其吸收和熒光不受 2 至 11 的 pH 值變化的影響。與花青染料不同，ATTO 647N 在大氣臭氧存在下表現出出色的穩定性，這使其對于微陣列應用特別有價值。 ATTO 647N 適合一系列科學應用，包括單分子檢測、SIM 和 STED 等高分辨率顯微鏡技術，以及流式細胞術 (FACS) 和熒光原位雜交 (FISH)。 ATTO 647N 馬來酰亞胺用于標記含硫醇的分子，例如蛋白質、抗體、配體和寡核苷酸硫代磷酸鹽。

圖1.熒光染料馬來酰亞胺是通過 SH 基團將染料與肽、蛋白質、抗體、硫醇修飾的寡核苷酸或核酸結合的常用工具。馬來酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質的硫醇基團、硫醇修飾的寡核苷酸和其他含硫醇的分子發生反應。所得的染料綴合物相當穩定。

二.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺參數

Ex(nm)    318

Em(nm)    663

分子量    N/A

溶劑      DMSO

存儲條件    在-15℃以下保存，避光防潮

三.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺實驗方案

溶液配制方案

除非另有說明，所有未使用的儲備溶液應分成一次性等份，并在制備后儲存在-20°C。避免反復凍融循環。

1.ATTO 647N 馬來酰亞胺儲備溶液（溶液 B） ：

將無水 DMSO 添加到 ATTO 647N 馬來酰亞胺小瓶中，制成 10 mM 儲備溶液。通過移液或渦旋充分混合。

注意：

開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液 B）。及時使用。延長儲存染料原液可能會降低染料活性。避光防潮時，溶液 B 可在冰箱中保存長達 4 周。避免凍融循環。

2. 蛋白原液（A液）

將 100 μL 反應緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標蛋白溶液（例如抗體，蛋白濃度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白標記庫存溶液。

注1：蛋白質溶液（溶液 A）的 pH 應為 6.5 ± 0.5。

注2：不純的抗體、穩定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應。可以通過透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標記結果。

注3：如果蛋白質濃度低于 2 mg/mL，結合效率會顯著降低。為了獲得標記效率，建議蛋白質濃度范圍為 2-10 mg/mL。

可選：如果您的蛋白質不含游離半胱氨酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質以生成硫醇基團。 DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用 DTT，則必須在將馬來酰亞胺染料與蛋白質結合之前通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例方案：

1.在蒸餾水中制備 1 M DTT (15.4 mg/100 μL) 的新鮮溶液。

2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液添加 20 μL DTT 庫存。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。

3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液”預平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。

4.確定蛋白質濃度并將大部分 IgG 的級分合并。這可以通過分光光度法或比色法來完成。

5.此步驟后盡快進行綴合（請參閱示例實驗方案）。

注意：為了獲得結果，IgG 溶液應 >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應濃縮。額外包括 10% 的緩沖液交換柱損失。

注意：幾乎可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進行還原，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。

注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。

樣品實驗方案：

該標記方案是針對山羊抗小鼠 IgG 與 ATTO 647N 馬來酰亞胺的綴合物而開發的。請您根據您的實際情況，進行操作。

注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的特性。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。

運行綴合反應：

1.使用 10:1 摩爾比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質）作為起點：將 5 μL 染料儲備溶液（溶液 B，假設染料儲備溶液為 10 mM）添加到蛋白質小瓶中溶液（95 μL 溶液 A）并有效搖動。假設蛋白質濃度為 10 mg/mL，蛋白質的分子量為 ~200KD，則蛋白質濃度為 ~0.05 mM。

注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質）摩爾比為 10:1 的溶液。如果太少或太高，則分別確定染料/蛋白質比例為 5:1、15:1 和 20:1。

2.繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化綴合：

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質綴合物的示例。

1.根據制造說明準備 Sephadex G-25 柱。

2.將反應混合物（來自“運行綴合反應”）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。

3.當樣品剛好流到頂部樹脂表面下方時，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

4.向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質綴合物的級分。

注意：如需立即使用，染料-蛋白質綴合物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注意：為了長期儲存，染料-蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。