酶聯免yi吸附試驗（簡稱ELISA）概述

ELISA是一種基于平板的免yi測定法，用于檢測和定量生物分子如抗體、蛋白質、激su或肽，以及蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用的角色塑造。在ELISA中，感興趣的靶標(通常是抗原)被固定在固體表面上，然后用與酶(如辣根過氧化物酶蛋白(HRP)或堿性磷酸酶蛋白(AP))結合的抗體進行探測。定量是通過與底物孵育實現的，底物是由酶催化的，產生可測量的副產品。酶聯免yi吸附法一般分為三類:直接ELISA、間接ELISA和三明治ELISA。

一.直接ELISA

在直接ELISA中,抗原通過被動吸附直接固定在平板表面,并用HRP標記的原抗體檢測。將無色底物引入樣品,樣品與酶結合物反應,產生可測量的副產物。根據襯底的選擇,這種副產品可以是比色的,化學發光的或熒光的。信號產生的數量與樣品中抗原的數量成正比。在所有的酶聯免yi吸附測定格式中,直接酶聯免yi吸附測定是簡單和快的,然而,它們是不敏感的。

比色直接ELISA

實驗方法：

1. 用檢測抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養的酶聯免yi吸附試驗板

2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3. 在4攝氏度時,用所需封塊溶液進行1小時的封塊板

4. 用緩沖器洗盤子3次

5. 在室溫下用HRP標記的原抗體注射1小時

6. 用緩沖器洗盤子4次

7. 帶重復使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號) 11012 在室溫下持續15-30分鐘。

8. 用酶聯免yi吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號

二.間接ELISA

間接ELISA實質上是直接ELISA的修正版。在間接酶聯免yi吸附法中,用于檢測抗原的主要抗體是不結合的。取而代之的是一種酶標記的次級抗體,它對主抗體的寄種具有反應性,用于檢測主抗原復合物(間接檢測抗原)。將無色底物引入樣品中,樣品與酶結合物反應,產生可測量的副產物。根據底物的選擇,這種副產物可以是比色的,化學發光的或熒光的。信號產生的數量與樣品中抗原的數量成正比。二次檢測試劑的使用優于直接酶聯免yi吸附測定(即信號放大)。

比色法間接ELISA

試驗方法：

1.用檢測抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養的酶聯免yi吸附試驗板

2.用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3.在4攝氏度時,用所需封塊溶液進行1小時的封塊板

4.用緩沖器洗盤子2次

5.常溫下未結合初級抗體植入1小時

6.用緩沖器洗盤子4次

7.用HRP標記的二次抗體在室溫下植入1小時(阻斷緩沖)

8.用緩沖器洗盤子4次

9.帶重復使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號) 11012 在室溫下持續15-30分鐘。

10.用酶聯免yi吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號

三．三明治ELISA

它要求使用匹配的抗體,每個抗體是針對不同的無重疊抗原表位。其中一種抗體,稱為捕捉抗體,首先被涂在一個多井微滴板的表面,以促進固定目標抗原。然后di二種抗體,稱為檢測抗體,結合到捕捉抗體-抗原復合物(因此術語"三明治",因為抗原是結合在匹配的抗體對之間)。添加了檢測抗體(而不是捕捉抗體)的酶標記次級抗體結合物。一旦二次結合到檢測抗體,酶標記次級抗體催化反應與其各自的底物產生可測量的信號。

比色三明治ELISA

試驗方法：

1. 含有捕捉抗體、密封板和4攝氏度夜間孵化的pcv微滴板覆蓋井

2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3. 在4攝氏度時,用所需封塊溶液進行1小時的封塊板

4. 用所需的緩沖器洗盤子2次

5. 在每一口井中添加樣品,在37℃條件下孵化2小時

6. 用所需的緩沖劑將樣品和清洗板拆下2次

7. 常溫下注射1小時非結合檢測抗體

8. 用所需的緩沖器洗盤子4次

9. 用HRP標記的二次抗體在室溫下植入1小時(阻斷緩沖)

10. 用所需的緩沖器洗盤子4次

11. 帶重復使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號) 11012 在室溫下持續15-30分鐘。

12. 用酶聯免yi吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號