Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細胞增殖與活性檢測試劑盒是百螢生物生產的一種基于 WST-8 的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。百螢生物是 AAT Bioquest 中國區域代理商，為國內提供 AAT 的原裝產品及產品定制、技術服務，歡迎咨詢、訂購！

實驗方案

1.在96 孔板中配置100μL的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μL2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μL5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實驗需要，進行培養（在37°C，5%CO2的條件下）預培養24 小時。

2.向培養板加入1-10μL 不同濃度的待測藥品刺激。

3.將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24 或48 小時）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數）。如果起始的培養體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推?？梢杂眉恿讼鄳考毎囵B液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔心所使用的**會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養液、藥品和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。

5.在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，對于大多數情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

6.用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7.如果暫時不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK 之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥品影響。當然藥品影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥品后的空白吸收即可。

注意事項：

1.由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。

2.CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。

3.建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。

4.建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK 試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加樣，容易產生氣泡，會干擾OD 值讀數。

5.當使用標準96 孔板時，貼壁細胞的小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL培養基)，且培養時間長一些。如果要使用24 孔板或6 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色已變化或pH值變化。建議換用新鮮的培養基。

7.如果沒有450nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm 濾光片的檢測靈敏度高。

8.酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9.為了您的健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

實驗圖：

圖 2. CCK-8 檢測細胞活性原理圖

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